Διαφορά μεταξύ Sanger Sequencing και Pyrosequencing | Sanger Sequencing vs Pyrosequencing

Διαφορά κλειδιού - αλληλουχία Sanger κατά Pyrosequencing

της σωστής διάταξης νουκλεοτιδίων σε μια συγκεκριμένη περιοχή DNA αποκαλύπτει πολλές σημαντικές πληροφορίες γι 'αυτήν. Υπάρχουν διαφορετικές μέθοδοι προσδιορισμού αλληλουχίας του DNA. Η αλληλούχιση Sanger και η Pyrosequencing είναι δύο διαφορετικές μέθοδοι προσδιορισμού ακολουθίας DNA που χρησιμοποιούνται ευρέως στη Μοριακή Βιολογία. Η βασική διαφορά μεταξύ της αλληλουχίας Sanger και της Pyrosequencing είναι ότι η αλληλούχιση του Sanger χρησιμοποιεί διδεοξυνουκλεοτίδια για να τερματίσει τη σύνθεση του DNA για να διαβάσει την αλληλουχία νουκλεοτιδίων ενώ η πυροεπιλεκτοποίηση ανιχνεύει την απελευθέρωση του πυροφωσφορικού με την ενσωμάτωση των νουκλεοτιδίων και τη σύνθεση της συμπληρωματικής αλληλουχίας για να διαβάσει την ακριβή σειρά αλληλουχία.

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ

1. Επισκόπηση και διαφορά κλειδιού

2. Τι είναι η Sanger Sequencing

3. Τι είναι το Pyrosequencing

4. Σύγκριση μεταξύ τους - Ακολουθία Sanger vs Pyrosequencing

5. Περίληψη

Τι είναι η ακολουθία Sanger;

Η αλληλούχιση του Sanger είναι μια μέθοδος γενετικής ακολουθίας πρώτης γενιάς που αναπτύχθηκε από τον Frederick Sanger και τα κολέγια του το 1977. Είναι επίσης γνωστή ως

Sequencing Termination Chain ή Dideoxy sequencing τερματισμού αλύσου με διδεοξυνουκλεοτίδια (ddNTPs). Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιήθηκε ευρέως για περισσότερα από 30 χρόνια μέχρι να αναπτυχθεί η νέα γενετική ακολουθία (NGS). Η τεχνική προσδιορισμού αλληλουχίας Sanger επέτρεψε την ανακάλυψη της σωστής σειράς νουκλεοτιδίων ή της προσκόλλησης ενός συγκεκριμένου τεμαχίου ϋΝΑ. Βασίζεται στην εκλεκτική ενσωμάτωση των ddNTPs και στον τερματισμό της σύνθεσης ϋΝΑ κατά την διάρκεια της αναπαραγωγής ϋΝΑ in vitro DNA. Η απουσία ομάδων 3 'ΟΗ για τη συνέχιση του σχηματισμού δεσμού φωσφοδιεστέρα μεταξύ γειτονικών νουκλεοτιδίων είναι ένα μοναδικό χαρακτηριστικό των ddNTPs. Συνεπώς, μόλις συνδεθεί το ddNTP, η επιμήκυνση της αλυσίδας παύει και τερματίζεται από το σημείο αυτό. Υπάρχουν τέσσερα ddNTPs - ddATP, ddCTP, ddGTP και ddTTP - που χρησιμοποιούνται στην αλληλούχιση του Sanger. Αυτά τα νουκλεοτίδια σταματούν τη διαδικασία αντιγραφής του DNA όταν ενσωματώνονται στον αναπτυσσόμενο κλώνο του DNA και έχουν ως αποτέλεσμα ποικίλα μήκη βραχέων DNA. Η ηλεκτροφόρηση τριχοειδούς πηκτής χρησιμοποιείται για την οργάνωση αυτών των σύντομων κλώνων ϋΝΑ με τα μεγέθη τους σε ένα πήκτωμα όπως φαίνεται στο σχήμα 01.

Εικόνα 1: Ηλεκτροφόρηση τριχοειδούς πηκτής σύνθετου σύντομου DNA

Για in vitro

αναπαραγωγή DNA, πρέπει να παρέχονται λίγες απαιτήσεις. Αυτά είναι ένζυμα ϋΝΑ πολυμεράσης, εκμαγείο ϋΝΑ, ολιγονουκλεοτιδικά εναρκτήρια μόρια και δεοξυνουκλεοτίδια (dNTPs). Στην αλληλούχιση του Sanger, η αντιγραφή του DNA πραγματοποιείται σε τέσσερις ξεχωριστούς δοκιμαστικούς σωλήνες μαζί με τέσσερις τύπους ddNTP ξεχωριστά. Τα δεσοξυνουκλεοτίδια δεν αντικαθίστανται πλήρως από τα αντίστοιχα ddNTPs. Ένα μείγμα του συγκεκριμένου dNTP (για παράδειγμα, dATP + ddATP) περιλαμβάνεται στο σωλήνα και αναδιπλασιάζεται. Τέσσερα ξεχωριστά προϊόντα σωληνώσεων εκτελούνται σε ένα πήκτωμα σε τέσσερα χωριστά φρεάτια. Στη συνέχεια, διαβάζοντας την πηκτή, η ακολουθία μπορεί να κατασκευαστεί όπως φαίνεται στο σχήμα 02. Εικόνα 02: Ανάλυση αλληλουχίας Sanger Η αλληλούχιση του Sanger είναι μια σημαντική τεχνική που βοηθά σε πολλούς τομείς της μοριακής βιολογίας. Το έργο ανθρώπινου γονιδιώματος ολοκληρώθηκε επιτυχώς με τη βοήθεια μεθόδων βασισμένων σε αλληλούχιση του Sanger. Ο προσδιορισμός αλληλουχίας του Sanger είναι επίσης χρήσιμος στην ανάλυση αλληλουχίας στόχου, στην έρευνα του καρκίνου και στην γενετική ασθένεια, στην ανάλυση γονιδιακής έκφρασης, στην ανθρώπινη ταυτοποίηση, στην ανίχνευση παθογόνων, στην μικροβιακή αλληλούχιση κλπ.

Υπάρχουν πολλά μειονεκτήματα της αλληλουχίας Sanger:

η αλληλουχία δεν μπορεί να είναι μεγαλύτερη από 1000 ζευγάρια βάσης

Μόνο ένας κλώνος μπορεί να αλληλουχηθεί κάθε φορά.

Η διαδικασία είναι χρονοβόρα και δαπανηρή.

• Επομένως, αναπτύχθηκαν νέες τεχνικές προηγμένης αλληλουχίας με το χρόνο να ξεπεραστούν αυτά τα προβλήματα. Ωστόσο, ο προσδιορισμός αλληλουχίας του Sanger εξακολουθεί να χρησιμοποιείται λόγω των εξαιρετικά ακριβών αποτελεσμάτων, μέχρι περίπου 850 θραύσματα μήκους ζεύγους βάσεων.
• Τι είναι το Pyrosequencing;
• Το Pyrosequencing είναι μια νέα τεχνική προσδιορισμού αλληλουχίας DNA που βασίζεται στην "αλληλούχιση με σύνθεση". Αυτή η τεχνική βασίζεται στην ανίχνευση απελευθέρωσης πυροφωσφορικού μετά την ενσωμάτωση νουκλεοτιδίων. Η διαδικασία χρησιμοποιείται από τέσσερα διαφορετικά ένζυμα: πολυμερή ϋΝΑ, σουλφουρυλάση ΑΤΡ, λουσιφεράση και αφυράση και δύο υποστρώματα 5 'φωσφοθειϊκής αδενοσίνης (APS) και λουσιφερίνης.

Η διαδικασία ξεκινά με τη δέσμευση του εκκινητή με το μονόκλωνο πρότυπο ϋΝΑ και η ϋΝΑ πολυμεράση ξεκινά την ενσωμάτωση νουκλεοτιδίων συμπληρωματικών αυτής. Όταν τα νουκλεοτίδια ενώνουν μαζί (πολυμερισμός νουκλεϊκού οξέος), απελευθερώνει πυροφωσφορικά (δύο φωσφορικές ομάδες που συνδέονται μεταξύ τους) ομάδες και ενέργεια. Κάθε προσθήκη νουκλεοτιδίων απελευθερώνει ισομοριακή ποσότητα πυροφωσφορικού. Το πυροφωσφορικό μετατρέπεται σε ΑΤΡ με σουλφυρυλάση ΑΤΡ υπό την παρουσία υποστρώματος APS. Το παραγόμενο ΑΤΡ οδηγεί τη μεσολάβηση της λουσιφεράσης με τη μεσολάβηση της λουσιφεράσης στην οξυλουσιφερίνη, παράγοντας ορατό φως σε ποσότητες που είναι ανάλογες με την ποσότητα των ΑΤΡ. Το φως ανιχνεύεται από μια συσκευή ανίχνευσης φωτονίων ή από φωτοπολλαπλασιαστή και δημιουργεί ένα πυρογράφημα. Η απυράση αποικοδομεί ATP και μη ενσωματωμένα dNTP στο μίγμα της αντίδρασης. Η προσθήκη dNTP γίνεται μία φορά τη φορά. Επειδή η προσθήκη νουκλεοτιδίου είναι γνωστή σύμφωνα με την ενσωμάτωση και την ανίχνευση του φωτός, μπορεί να προσδιοριστεί η αλληλουχία του προτύπου.Το πυρογράμμα χρησιμοποιείται για τη δημιουργία της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του δείγματος DNA όπως φαίνεται στο σχήμα 03.

Η πυροαυξημένη αλληλουχία είναι πολύ σημαντική στην ανάλυση πολυμορφισμού ενός νουκλεοτιδίου και στην ανάλυση αλληλουχίας μικρών τμημάτων DNA. Η υψηλή ακρίβεια, η ευελιξία, η ευκολία αυτοματοποίησης και η παράλληλη επεξεργασία είναι τα πλεονεκτήματα της πυροσυστολής των τεχνικών προσδιορισμού αλληλουχίας του Sanger.

Εικόνα 03: Pyrosequencing

Ποια είναι η διαφορά μεταξύ του Sanger Sequencing και του Pyrosequencing;

- Διαφορετικό Μέσο πριν από τον Πίνακα ->

Sanger Sequencing vs. Pyrosequencing

Η αλληλούχιση του Sanger είναι μια μέθοδος προσδιορισμού αλληλουχίας DNA βασισμένη στην επιλεκτική ενσωμάτωση ddNTPs με ϋΝΑ πολυμεράση και τερματισμό αλυσίδας.

Το Pyrosequencing είναι μια μέθοδος προσδιορισμού αλληλουχίας DNA που βασίζεται στην ανίχνευση απελευθέρωσης πυροφωσφορικού μετά την ενσωμάτωση νουκλεοτιδίου.

Χρήση ddNTP
ddNTPs χρησιμοποιούνται για να τερματίσει την αναπαραγωγή του DNA	ddNTPs δεν χρησιμοποιούνται.
Χρησιμοποιούνται ενζύμια
DNA πολυμεράση.	Χρησιμοποιούνται τέσσερα ένζυμα: πολυμεράση DNA, σουλφυρυλάση ΑΤΡ, λουσιφεράση και Apyrase.
Τα χρησιμοποιούμενα υποστρώματα
APS και Luciferin δεν χρησιμοποιούνται.	Χρησιμοποιείται φωσφοθειϊκό 5 'αδενοσίνης (APS) και λουσιφερίνη.
Μέγιστη θερμοκρασία
Πρόκειται για αργή διαδικασία.	Αυτή είναι μια γρήγορη διαδικασία.
Περίληψη - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
Η αλληλούχιση Sanger και η Pyrosequencing είναι δύο μέθοδοι προσδιορισμού ακολουθίας DNA που χρησιμοποιούνται στη μοριακή βιολογία. Η αλληλούχιση Sanger κατασκευάζει τη σειρά των νουκλεοτιδίων σε αλληλουχία με τερματισμό της επιμήκυνσης της αλυσίδας ενώ η πυροεπιλεκτοποίηση κατασκευάζει την ακριβή σειρά των νουκλεοτιδίων σε αλληλουχία με ενσωμάτωση νουκλεοτιδίων και ανίχνευση απελευθέρωσης πυροφωσφορικών. Ως εκ τούτου, η κύρια διαφορά μεταξύ της αλληλούχησης Sanger και της Pyrosequencing είναι ότι η αλληλούχιση του Sanger δουλεύει στην αλληλούχιση με τερματισμό της αλυσίδας, ενώ οι πυροεπιλεκτοποιήσεις δουλεύουν στην αλληλούχιση με σύνθεση.	Αναφορά:

1. Φακρουδίν, Md και Abhijit Chowdhury. "Pyrosequencing-Μια εναλλακτική λύση στην παραδοσιακή sequencing Sanger. "American Journal of Biochemistry and Biotechnology. Επιστημονικές δημοσιεύσεις, 02 Μαρτίου 2012. Web. 28 Φεβρουαρίου 2017.

2. "Η αλληλουχία του Sanger. "Η αλληλουχία του Sanger - Θέματα ScienceDirect. Ν. Ρ., n. ρε. Ιστός. 28 Φεβρουαρίου 2017

Ευγένεια εικόνας:

1. "Didesoxy-Methode" Από τον Christoph Goemans (τροποποιημένο) - Ο Δρ. Norman Mauder, στη βάση δεδομένων του Christoph Goemans (CC BY-SA 3. 0) μέσω Wikimedia Commons

2. "Sanger-DNA-seq" Από Enzo στην πολωνική γλώσσα Wikipedia (CC BY-SA 3. 0) μέσω Wikimedia Commons

3. "Pyrosequencing" με μικροβιολογικούς τύπους (CC BY-SA 2. 0) μέσω Flickr