Διαφορά μεταξύ RT PCR και QPCR | RT PCR vs QPCR

Διαφορά κλειδιού - RT PCR vs QPCR

Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης είναι μια τεχνική που χρησιμοποιείται για την ενίσχυση συγκεκριμένης περιοχής DNA in vitro. Λόγω της εφεύρεσης αυτής της τεχνικής από τον Kary Mullis το 1983, οι επιστήμονες μπορούν να κάνουν χιλιάδες εκατομμύρια αντίγραφα ειδικών θραυσμάτων DNA για ερευνητικούς σκοπούς. Σήμερα έχει γίνει μια κοινή και συνηθισμένη τεχνική σε κλινικά και ερευνητικά εργαστήρια για μια ευρεία ποικιλία εφαρμογών. Υπάρχουν παραλλαγές της παραδοσιακής τεχνικής PCR όπως η RT PCR, η ένθετη PCR, η πολυπλεκτική PCR, η Q PCR, η RT-QPCR, κτλ. Οι RT PCR και Q PCR είναι δύο σημαντικές παραλλαγές της PCR. Η βασική διαφορά μεταξύ της RT PCR και της Q PCR είναι ότι η RT PCR χρησιμοποιείται για την ανίχνευση γονιδιακής έκφρασης μέσω της δημιουργίας μεταγραφών συμπληρωματικού DNA (cDNA) από RNA ενώ χρησιμοποιείται Q PCR για την ποσοτική μέτρηση των προϊόντων PCR σε πραγματικό χρόνο χρησιμοποιώντας φθορίζουσες χρωστικές ουσίες. ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ

1. Επισκόπηση και διαφορά κλειδιού

2. Τι είναι RT PCR

3. Τι είναι το QPCR

4. Σύγκριση μεταξύ των πλευρών - RT PCR vs QPCR

5. Περίληψη

Τι είναι η RT PCR;

Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης ανάστροφης μεταγραφής (RT PCR) είναι μια παραλλαγή της PCR η οποία χρησιμοποιείται για την ανίχνευση έκφρασης RNA. Είναι μια πολύ σημαντική μέθοδος για την ανίχνευση της έκφρασης του mRNA στους ιστούς. Χρησιμοποιείται RT PCR όταν το αρχικό υλικό του δείγματος είναι RNA. Στην RT PCR, το mRNA του προτύπου μετατρέπεται πρώτα σε συμπληρωματικό DNA. Αυτό το στάδιο καταλύεται από το ένζυμο αντίστροφη μεταγραφάση και η διαδικασία είναι γνωστή ως ανάστροφη μεταγραφή. Δεύτερον, χρησιμοποιείται παραδοσιακή PCR για το νέο συντιθέμενο cDNA για την ενίσχυση.

RT PCR είναι μια εξαιρετικά ευαίσθητη τεχνική η οποία απαιτεί σχετικά μικρή ποσότητα δείγματος RNA. Η RT PCR χρησιμοποιείται συνήθως στη διάγνωση και την ποσοτικοποίηση ειδών RNA, ιδιαίτερα ιών RNA όπως ο ιός της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας και ο ιός της ηπατίτιδας C.

Εικόνα 01: Τεχνική RT PCR

Τι είναι το QPCR;

Η ποσοτική PCR (QPCR) είναι μια παραλλαγή της PCR η οποία χρησιμοποιείται για την ποσοτική μέτρηση των προϊόντων PCR. Αναφέρεται επίσης ως αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο, καθώς μετρά την ενίσχυση του πραγματικού χρόνου χρησιμοποιώντας μηχανή PCR πραγματικού χρόνου. Είναι μια κατάλληλη μέθοδος για τον προσδιορισμό της ποσότητας μιας αλληλουχίας στόχου ή γονιδίου που υπάρχει σε ένα δείγμα. Το ενδιαφέρον χαρακτηριστικό του QPCR είναι ότι συνδυάζει τόσο την ενίσχυση όσο και την πραγματική ποσοτικοποίηση σε ένα μόνο βήμα. Συνεπώς, η ανάγκη για ηλεκτροφόρηση πηκτής στην ανίχνευση μπορεί να εξαλειφθεί με την τεχνική QPCR. Το QPCR χρησιμοποιεί φθορίζουσες χρωστικές για να επισημάνει τα προϊόντα PCR κατά τη διάρκεια των αντιδράσεων PCR που τελικά οδηγούν σε άμεση ποσοτικοποίηση.Όταν συσσωρεύονται τα προϊόντα PCR, τα φθορίζοντα σήματα συσσωρεύονται και θα μετρηθούν από τη μηχανή πραγματικού χρόνου. Το QPCR μπορεί να συνδυαστεί με RT PCR. Είναι γνωστό ως RT - QPCR ή QRT - PCR και θεωρείται ως η πιο ισχυρή, ευαίσθητη και ποσοτική μέθοδος ανίχνευσης επιπέδων RNA στα κύτταρα ή στους ιστούς.

Το SYBR Green και το Taqman είναι δύο μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση ή την παρακολούθηση της διαδικασίας ενίσχυσης της PCR σε πραγματικό χρόνο. Η μέθοδος SYBR Green πραγματοποιείται χρησιμοποιώντας μια φθορίζουσα βαφή που ονομάζεται SYBR πράσινη και ανιχνεύει την ενίσχυση δεσμεύοντας τη βαφή για να παράγει διπλόκλωνο DNA. Το Taqman διεξάγεται χρησιμοποιώντας ανιχνευτές διπλής σήμανσης και ανιχνεύει την ενίσχυση με αποικοδόμηση του ανιχνευτή με πολυμεράση Taq και απελευθερώσεις του φθοροφόρου όπως φαίνεται στο σχήμα 02. Αμφότερες οι μέθοδοι παρακολουθούν την πρόοδο της διαδικασίας ενίσχυσης και αναφέρουν την ποσότητα του προϊόντος σε πραγματικό χρόνο.

Η PCR σε πραγματικό χρόνο έχει μια ευρεία ποικιλία εφαρμογών όπως η ποσοτικοποίηση της γονιδιακής έκφρασης, η ανάλυση του RNA του microRNA και της μη κωδικοποίησης, η γονοτυπία SNP, η ανίχνευση παραλλαγών αριθμού αντιγράφων, η ανίχνευση σπάνιων μεταλλάξεων, η ανίχνευση γενετικά τροποποιημένων οργανισμών,

Εικόνα 02: Ποσοτική τεχνική PCR

Ποια είναι η διαφορά μεταξύ RT PCR και QPCR;

- άρθρο diff Μέσο πριν από τον πίνακα ->

RT PCR vs QPCR

Η RT PCR είναι μια τεχνική που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση γονιδιακής έκφρασης με ενίσχυση.

Το QPCR είναι μια τεχνική που ενισχύει το DNA και ποσοτικοποιεί τα προϊόντα PCR σε πραγματικό χρόνο.

Συμμετοχή ενζύμου αντίστροφης μεταγραφάσης
Χρησιμοποιείται ένζυμο αντίστροφης τρανσκριπτάσης για RT PCR.	Η αντίστροφη μεταγραφάση του ενζύμου δεν χρησιμοποιείται για QPCR.
Χρήση φθοριζόντων επισημασμένων μορίων
Οι χρωστικές ή ανιχνευτές με φθορίζουσα σήμανση δεν χρησιμοποιούνται για RT PCR.	Οι χρωστικές ή ανιχνευτές με φθορίζουσα σήμανση χρησιμοποιούνται για το QPCR.
Ποσοτικοποίηση του προϊόντος PCR
Εκτός εάν συσχετίζεται με QPCR, η RT PCR δεν ποσοτικοποιεί το προϊόν PCR.	Το QPCR μετρά ποσοτικά το προϊόν PCR.
Αρχικό υλικό
Το αρχικό υλικό είναι mRNA.	Το αρχικό υλικό είναι DNA.
Σύνθεση του cDNA
Το συμπληρωματικό DNA παράγεται κατά τη διάρκεια της RT PCR.	Το συμπληρωματικό DNA δεν παράγεται κατά τη διάρκεια του QPCR.
Περίληψη - RT PCR vs QPCR
RT PCR και QPCR είναι δύο εκδόσεις της παραδοσιακής PCR. Η τεχνική RT PCR διεξάγεται για δείγματα mRNA και οδηγείται με αντίστροφη μεταγραφή και παραγωγή cDNA. Το QPCR χρησιμοποιείται για την ποσοτικοποίηση των προϊόντων PCR κατά τη διάρκεια των θερμικών κύκλων PCR σε πραγματικό χρόνο χρησιμοποιώντας φθορίζουσες χρωστικές ή επισημασμένους ανιχνευτές. Στο QPCR, η ποσότητα του προϊόντος PCR αντιπροσωπεύεται από τα εκπεμπόμενα φθορίζοντα σήματα από το δείγμα. Η RT PCR χρησιμοποιείται ευρέως ως διαδικασία ενίσχυσης ενώ το QPCR χρησιμοποιείται συνήθως ως διαδικασία ποσοτικοποίησης. Αυτή είναι η διαφορά μεταξύ RT PCR και QPCR.	Αναφορές:

1. Deepak SA, KR Kottapalli, R. Rakwal, G. Oros, KS Rangappa, Η. Iwahashi, Y. Masuo και GK Agrawal. "PCR σε πραγματικό χρόνο: Επανεξέταση ανίχνευσης και έκφρασης των γονιδίων. "Τρέχουσα γονιδιωματική.Bentham Science Publishers Ltd., Ιούνιος 2007. Web. 03 Απρ. 2017

2. Zeka, Fjoralba, Katrien Vanderheyden, Els De Smet, Claude A. Cuvelier, Pieter Mestdagh και Jo Vandesompele. "Ευθεία και ευαίσθητη ανάλυση γονιδιακής έκφρασης βασισμένη σε RT-qPCR δειγμάτων FFPE. "Φύση News. Nature Publishing Group, 22 Φεβρουαρίου 2016. Web. 03 Απρ. 2017

3. Overbergh, L., Α. Giulietti, D. Valckx, Β. Decallonne, R. Bouillon και C. Mathieu. "Η χρήση PCR αντίστροφης μεταγραφάσης σε πραγματικό χρόνο για την ποσοτικοποίηση της έκφρασης γονιδίων κυτοκίνης. "Journal of Biomolecular Techniques: JBT. Ο Σύνδεσμος Εγκαταστάσεων Βιομοριακών Πόρων, Mar. 2003. Web. 03 Απρ. 2017

Ευγένεια εικόνας:

1. "Taqman" από χρήστη: Braindamaged - δική του δουλειά από τον αρχικό χρήστη (Public Domain) μέσω Wikimedia Commons

2. "Αντίστροφη αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης μεταγραφής" Από Jpark623 - Ίδια εργασία (CC BY-SA 3. 0) μέσω Wikimedia Commons